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药用真菌液体发酵培养的研究……

刘少琴赵紫华 马彩霞 霍竹林
药用真菌是指对疾病有治疗、预防或抑制作用以及对人体有保健作用的一类真菌,其药用部位有子实体、菌核菌丝体和发酵液等。
由于目前我国中药无序开发,资源枯竭,生物多样性锐减,多数药用真菌的天然资源稀缺;人工栽培由于生长期长,受外界环境因素影响大,难以满足社会需求。而液体发酵技术简易可行,在发酵过程中除菌丝或孢子大量增殖外,还会产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素等多种具有生理活性的物质,具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效,因此药用真菌的液体发酵技术成为了中药研发的一个重要方向”。
药用真菌的种类多、分布广、繁殖快,有41科、110属。目前,已探明的具有药效的真菌多达400余种。药用真菌中大部分是子囊菌和担子菌。担子菌药用种数约占药用真菌的90%,其中70%的药用种集中在6个较大的科,即多孔菌科、口蘑科、红菇科、牛肝菌科、马勃科和蘑菇科等。子囊菌中的药用种主要集中在麦角菌科、肉座菌科、黑粉菌科等。
随着研究的深入,研究人员又发现了多种药用真菌,如产紫杉醇的内生真菌、红树林内生真菌、小蜜环菌、鸡茯苓、安络小皮伞、层卧孔菌、槐耳、金顶蘑、竹红菌、硫磺菌等。
1 药用真菌液体发酵进展
液体发酵技术是随着抗生素工业发展起来并运用到药用真菌发酵中的。近年来,药用真菌发酵技术应用越来越广泛,改进发酵条件,提高产物品质,降低发酵成本,是液体发酵研究的重点。
1.1担子菌液体发酵进展
担子菌中常用药材主要有茯苓、猪苓、灵芝、紫芝、雷丸、马勃、银耳、猴头菌、云芝、竹黄、侧耳等。其中对灵芝、茯苓、猪苓等的发酵,研究人员进行了深入的探讨,也取得了一些成果。
1.1.1灵芝 灵芝是传统中药,能够增强体质,抵御疾病。灵芝中含有的灵芝多糖和灵芝酸类物质能够抑制肿瘤、抗病毒、保肝和抗衰老等。目前,人们大多采用人工栽培的灵芝子实体加工成各种药物和保健品,但人工栽培生长周期长,产量低,不能满足需要。液体深层发酵法将灵芝真菌培养到菌丝体而没有进入子实体阶段,生产周期大大缩短。张玉珠等”’对培养基成分进行了研究,确定了灵芝菌的常规发酵配方、最佳碳源、氮源组合及最佳发酵工艺参数,梁剑光等”’认为在培养基中加入一定量的Fe2+有利于胞外多糖的累积。1.1.2灰树花 灰树花是一种珍贵的大型药用真菌,在外国-日本俗称舞茸。它隶属于真菌门多孔菌属P01.yporus。灰树花具有显著的抗肿瘤、降血糖、抗肝炎、抗HIV病毒以及改善免疫系统功能等功效,已开发出保力生胶囊和维吉尔胶囊、外国-日本的MAIEXT以及外国-美国的Grifron系列产品。
灰树花对碳源的利用广泛,单糖、双糖、多糖均可利用,但是葡萄糖有利于灰树花菌丝体的生长。灰树花对有机氮的利用强于无机氮。有机氮以天然农副产品中的麦麸为最好;在无机氮中,灰树花对铵态氮的利用略强于对硝态氮的利用。卜庆梅确定了灰树花培养条件:pH值6.0,接种量10%,25℃,150—180r.rain一,灰树花菌丝体在中等装液量(500mL三角瓶装液量150mL)下,振荡培养144h即可结束发酵,发酵周期较短,便于大规模工业生产。周建树等认为以玉米粉为碳源,蛋白胨为氮源,添加无机盐KH,P04、MgS04、CaC03和少量的琼脂,最适合灰树花菌丝的生长。在pH6.O,转速160r.min一,温度25℃的条件下进行培养,菌丝生物量达到150.5g.L-1.
1.1.3茯苓 茯苓是我国八大中药之一,具有利尿、渗湿、补脾、安神等功能,野生或人工树根种植生产茯苓,受到产地和气候条件等的制约,因此发酵培养成为茯苓研究的重点。
李羿等初步探讨了茯苓液体发酵的最适发酵条件,刘忠义等用麦芽汁液体为培养基,碳源为蔗糖,最佳pH值为5.5,28℃的条件进行培养,培养周期96h。研究过程发现茯苓菌人工培养极易污染,采用了严格无菌操作、培养基中添加亚硫酸钠抑制根霉生长、pH值小于6等项避免杂菌污染的措施。王谦等对茯苓菌株进行发酵培养,120h后可达到30g.(100mL)(鲜重),发酵液中含有多种对身体有益的有机酸,发酵浓缩液多糖含量大于5mg.mL-1氨基酸含量大于480mg。(100mL)-1.
1.1.4密环菌 蜜环菌(Armillaria)又称蜜环蕈、青冈菌,分布于我国大部分地区,属担子菌纲伞菌自由蘑科,是名贵中药天麻Gastrodia elata B1.和猪苓PoJrPorus umbellatatus(Pers.)栽培必备的共生菌。蜜环菌的菌索侵入天麻块茎或猪苓菌核后被后者消化利用,成为它们惟一的营养源。同时蜜环菌自身又是重要的药食兼用真菌,具有镇静、抗惊厥、增强耐缺氧能力及增强肌体免疫功能等作用,蜜环菌子实体的多肽葡聚糖对肉瘤S一180有一定的抑制作用。
李素玲等发现黑暗对密环菌菌丝体的生长有明显的促进作用,而光照则起抑制作用,在密环菌生长的培养基中,最好的碳源是葡萄糖,最适宜的pH值为5.O-6.0,温度为25℃。与其他腐生真菌相比,密环菌苗丝的生长需要氧气的浓度较高,良好的透气对密环菌的生长极其重要。
谭周进等认为红薯粉含有丰富的营养物质,作为碳源,蜜环菌液体发酵的菌丝产量和多糖产量都高于小麦粉和蔗糖作碳源;用豆粕粉作氮源菌丝得率高,以麸皮作氮源多糖产量高;消泡剂有利于菌丝的生长,过量不利于多糖产生;机械搅拌对菌丝的生长和多糖的产生都不利;蜜环菌液体发酵6d多糖含量达O.485mg。mL一1菌丝含量达20.8g.L一1
l.2子囊真菌液体发酵进展
近年来,以从冬虫夏草中分离的真菌纯培养物代替冬虫夏草的研究取得了巨大的经济和社会效益,掀起了包括蝙蝠蛾拟青霉、蝙蝠蛾多毛孢、蛹虫草等虫生真菌在内的研究热潮。
1.2.1冬虫夏草 冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.,简称虫草,是一种虫生真菌,冬虫夏草为名贵中药材,以全草人药,可保肺肾、补精髓、化痰止劳咳,多用于肺肾两虚症。常食可促进消化,、调节免疫功能,增强人体对多种疾病的抵抗力。冬虫夏草菌丝体中含有大量的蛋白质、碳水化合物、多种氨基酸、虫草酸、虫草素(coFdvce.pin)、环状缩羧肽、SOD等。
虫草属子囊菌,其生活史可分为分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。在人工培养、液体发酵等实际生产中通常运用虫草菌的无性型。无性型判断最早由小林义雄1941年提出了5条标准,目前还有微循环产孢判定法、多指标印证法、DNA指纹图谱鉴定法等方法。目前对天然冬虫夏草无性型进行过分离研究的报道涉及有16个学名,12个属。用于发酵研究的主要有我国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉、被孢霉属、北虫草菌Y3、头孢菌改良菌株AIO等。
我国早在20世纪80年代就对冬虫夏草人工培养以及菌丝体的深层培养方面进行了大量的研究,取得了一定的进展。尚德静等确定了深层培养最适条件为24℃、200r.min一、pH值5.O左右,接种量5%一15%,菌丝生长的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨和氨基酸复合粉,最佳无机盐为KH2PO4、MgSO4和CaCl2。钟士清等对冬虫夏草头孢菌菌丝体液体发酵条件进行了详细的探讨:150mL三角瓶装20mL发酵液,旋转式水浴摇床 200r.min-126—28℃培养,pH 5~7,接种量5% (v/v)。发酵30h后菌丝达到最高生长量。冬虫夏草液体深层发酵一般pH值为自然控制,而余晓斌等研究发现在pH5.5的时候能够增加液体深层发酵的菌丝体和胞外多糖的产量。
冬虫夏草具有极强的富集矿物质的能力,能够将离子态矿物质转化为生物大分子螯合物来开发冬虫夏草有免疫调节和高效补充矿物质的生物活性强化剂。胡征等研究了冬虫夏草对高浓度铁、锌、钙离子的耐受性,优化冬虫夏草生物活性强化剂液态发酵的生产条件,工业原料液态发酵最佳培养基配比:大豆2%,玉米4%,蔗糖4%,KH,P04 0.05%, MgSO4O.02%,Ca2+(CaCl,)0.3%,Fe2(FeS04)O.01%,Zn2+(ZnSO4)O.008%,起始pH 6.0,28℃,大通风量培养4d,菌体得率可达2.72%。
1.2.2蛹虫草 蛹虫草具有和冬虫夏草相似的活性成分和医疗保健功效,也是我国著名的中药材。蛹虫草人工培养所得虫草主要活性成分的含量比冬虫夏草还高,是最有可能代替冬虫夏草的虫草品种。张以俭等发现蛹虫草可利用葡萄糖或蔗糖为碳源,以牛肉膏为氮源,蛹虫草母种培养基的最佳配方为马铃薯200g,葡萄糖或蔗糖20g, 琼脂20g,KH2PO41g,MgSO4 O.5g,牛肉膏10g,水1 000mL。并认为判断母种优劣的重要依据是菌丝长势、转色深浅、孢子数量和接种效果三者之间的相关性。
温鲁等对液体培养蛹虫草氮源种类、氮源水平、碳源水平、动态变化、虫草素及腺苷含量进行研究,蚕蛹粉、豆粕和豆粉都是很好的氮源;碳源水平为3%一4%;振荡培养8d,培养液中虫草素总量是菌丝体中虫草素总量的6倍多;振荡培养7-9d,每瓶培养物的虫草素和腺苷总量达到10mg以上。
l.3内生真菌液体发酵进展内生真菌(Endophytes)主要是指植物内生真菌,生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状,与植物互惠共生的关系。大部分植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的化学成分。目前发现的内生真菌有子囊菌类、少数的担子菌和接合菌。由于目前分离的内生真菌种类多,菌种有一定的共性,一般研究人员把其作为单独一类的药用真菌进行研究。
1.3.l产紫杉醇的内生真菌 紫杉醇(Paclitaxael)是由外国-美国学者Wani自短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)的树皮中提取的二萜类生物碱,是近30余年来发现的最重要的抗肿瘤药物之一,在类风湿性关节炎、中风、早老性痴呆等疾病治疗上有较好的疗效。
1993年Stierle等从短叶红豆杉树皮率先分离到内生真菌一一安德氏紫杉霉(了axomyces andrean.ae),并从其发酵产物中分离出紫杉醇,为微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了新的途径。1993年周东坡等从东北红豆杉中分离到3株紫杉醇产生菌,1994年邱德有等从云南省红豆杉、东北红豆杉树皮中先后分离出80多个产紫杉醇或其类似物的内生真菌菌株。外国-日本、加拿大等国的科学家也各自从不同的红豆杉中分离出不同的紫杉醇产生菌。
陈建华等从云南省红豆杉和南方红豆杉中分离出230余株内生真菌,其中5株具有产紫杉醇的特性,菌株的最高产率约为1mg.L一1作者研究发现酒石酸铵、苯甲酸钠对菌丝体生长具有抑制作用,而较低浓度的乙酸铵(<0.05mmol.L-1和较高浓度的苯丙氨酸(>O.01mm01.L-1对菌丝体的生长有利。
1.3.2红树林内生真菌 红树林是生长在以赤道为中心的热带和亚热带的特有的胎生海洋木本植物群落,我国台湾省、广西、广东省、海南省、浙江省省南部沿岸等地都有分布。由于独特的生长环境,红树林已经成为海洋真菌的重要栖息地,从其中分离得到的内生真菌种类多种多样,代谢产物具有多种药用价值,已经引起了研究人员的广泛关注。
郑忠辉等采用平板倾注法分离得到125株内生真菌,在半海水或淡水配制的马铃薯培养基中进行发酵培养,其中11株具有很强的抗肿瘤作用。王军等也从香港海红树林分离得到的海洋真菌代谢产物中含有生物活性的生物胺,具有抗肿瘤、降压、调整心率失常、体外对抗脂质过氧化反应及减轻氧化损伤等作用。
环肽类化合物可作为抗生素、毒素、免疫抑制剂、离子转移调节器、蛋白粘合抑制剂、酶抑制剂等,李厚金等从红树林内源真菌2524号得到了动脉硬化5种肽类化合物。还有人从红树林内生真菌代谢产物中分离出抗癌药物异香毒素、神经保护剂和良好的抗癌试剂β一咔啉。
2 药用真菌液体发酵培养展望
目前生产的真菌单方或复方制剂有香云肝泰片、复方灵芝片、灵芝胶囊、灵芝北芪片、香菇菌多糖片、金水宝胶囊、至灵胶囊、心肝宝胶囊、益康胶囊、槐耳冲剂、亮菌片和猪苓多糖注射剂等100多个品种。
近几年研究人员在菌种分离、培养方式、过程等方面进行了研究,还在菌种筛选诱变,药用真菌的原生质体的制备、固体发酵、多糖的提取纯化等方面进行了探讨,为药用真菌的培养开拓了思路。
目前药用真菌发酵培养还存在一些问题:药用真菌本身不具有抗菌能力,易污染杂菌;菌种分离过程菌体消亡严重,继代培养难于成活等。
今后应该从以下几个方面加强研究:利用物理化学诱变技术、原生质体融合技术和基因工程技术进行优良菌种选育,加强发酵培养基的优化,提高对发酵过程动态监控水平,应用现代工程技术设计生产出适合微生物连续发酵且价格低廉的新型发酵罐、加强多菌种混合发酵等。
提高药用真菌发酵培养技术必将会为中药新药研发开辟新的道路,拓展更广阔的发展空间。也必将有利于推进中药现代化和全球-国际化进程,提高我国中药行业的全球-国际竞争力,为中药走向世界、造福全人类做出新的贡献。