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多糖的研究

管军军1,张春霞2

   
(1.江南大学食品学院,江苏无锡214036;2.浦江前吴中学,浙江浦江322200)
    [中图分类号]S816.7[文献标识码]AI文章编号]1005-8613(223)03-0032-03

   
1 前言
     多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别。细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等有着密切的关系。多糖在医药上还是一种很好的佐剂。近年来又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用。此外它还能控制细胞的分裂和分化,调节细胞的生长和衰老。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此,在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用等的研究方面,人们做了大量的工作。
   2 多糖的来源
   多糖广泛存在于植物、微生物(细菌和真菌)和海藻中,来源很广。其中研究得较早且最多的,是从细菌中得到的各种荚膜多糖,它在医药上主要用于疫苗;1984年,苏联人在荷兰召开的第十二次国际碳水化合物讨论会上报道了用全合成特定结构的荚膜多糖作疫苗,引起与会者的极大兴趣。尔后,有关真菌多糖的研究既深又广,如酵母菌多糖、食用菌多糖,特别是食用菌多糖的研究,报道的频率是相当的高,其中以香菇多糖研究得较清楚。另外,植物多糖的开发也备受人们的青睐,由于我国是中药的起源之地,而糖类是中药材中普遍存在的成分,在对各种中药材的化学成分研究的过程中,人们都少不了对其中多糖的关注。植物多糖研究得比较深入是稻草多糖、麦秸多糖、竹多糖、黄芪多糖、刺五茄多糖,海藻多糖虽然研究得不多,但其前途也是很光明的。

   
3 多糖的提取、分离纯化、纯度鉴定及分子量测定
     多糖是极性大分子化合物,大多采用不同温区的农、稳碱溶液提取,尽量避免在酸性条件下提取,以防引起糖苷键的断裂,稀酸提取时,时间宜短,温度不宜超过50℃。由于水提时间长且效率低,酸碱提易破坏多糖的立体结构及活性,现在有的采用菌法提取多糖,即采用复合酶一热水浸提相结合的方法,复合酶多采用一定比例的果胶酶。纤维素酶及中性蛋白酶,此法具有条件温和、杂质易除和提取率高等优点。
     多糖提取之后,其中还含有许多杂质要除去,一般首先利用多糖难溶于有机溶剂的特性,用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤,除去一部分醒溶性杂质,然后用Sevage法或三氟三氯乙烷法(微生物多糖)或三氯醋酸法(植物多糖),脱游离蛋白质。小分子杂质的除去可以用透析法。
     除去这些杂质之后,可以采用部分沉淀法、金属络合法、季铰盐沉淀法、甲醇分级沉淀法和制备性区域电泳等进行纯化,但大多数采用DEAE一纤维素、DEAE一凝胶及其他凝胶柱层析法进行纯化,国外采用LKB柱层析系统。多糖的检测可用比旋度、示差折射及紫外检测等方法,也可以用苯酚一硫酸法测定多糖。纯度的鉴定可以用超离心法、高压电泳法、凝胶过滤法、高效液相法、示差折射法、紫外检测法等。

   
4 多糖的结构分析
     多糖的结构描述包括分子量范围、单糖的组成、连接点类型、单糖和糖着键的构型及重复单元等。
   单糖组成分析的第一步是将多糖的糖音键完全断裂,方法有甲醇解、盐酸水解、硫酸水解、甲酸解及三氟醋酸催化的水解等,最常用的是三氟醋酸水解法,一般用
   20mol/L TFA, 120℃恒温 lh,或2moI/L TFA,100℃恒温 6h。然后将单糖进行分离。定性和定量。
     单糖的分离检测方法有KPLC、HPTC、CZE和HRCC等,GC测定糖组分时须在进样前进行化学衍生,如硅烷化和还原、乙酸化等,以提高样品的挥发度。多糖结构的分析方法还有甲基化分析法、高碘酸氧化法、Smith降解法、酸/碱部分降解法。特定酶的降解法等。近几年又将高效毛纫管电泳应用于糖结构的分析。随着现代仪器的发展,物理分析方法也在多糖结构分析中占有很重要的地位,如红外光谱、核磁共振、质谱分析等。
     多糖中游离蛋白成分的判断方法有:(l)聚丙烯酰胺凝胶电泳后,用考马斯亮兰R~250进行蛋白质染色。阿利新兰进行糖的染色;(2)8mol/L尿素处理后测蛋白质含量等。多糖中糖醛酸的鉴定可以用咋叹一硫酸法。分子量测定常用渗透压法、超过滤法、粘度法、光散射法、高压电泳法、高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、高效液相法、还原末端法及聚合度法。
5 多糖的功能活性
    多糖有多种多样的生物活性。目前,对多糖的化学研究以及生物功能的研究方兴未艾,不同来源多糖的潜在功能尚须进一步研究。专家预测,随着对多糖结构和功能关系的研究,将会产生生物学的新领域,导致医学上的高速发展和工农业上新的应用。
5.1 抗肿瘤
     人们已从不同的生物材料中得到多种具有抗肿瘤活性的多糖,如从香菇中得到的香菇多糖具有强的抗肿瘤活性,其抑制癌症和抗肿瘤效果不是直接作用于移植性癌细胞,而是通过宿主调节而发生作用。
     多糖类抗肿瘤性的构效关系:多糖的化学结构与生理活性间有相关性。如真菌多糖的分子立体结构对其活性的影响很大,凡具β一螺旋结构的多糖具有较强的生物功能。C-NMR分析推断,连接在β-(t-3)-D葡聚糖骨架上的多羟基团,对于抗肿瘤活性起重要作用。结构的化学修饰可提高多糖的活性,如原茯苓多糖没有抗癌作用,其主链为β-(t-3)一葡聚糖,具有β-(l一6)吡哺葡聚糖音支链,当它经过碘酸氧化、脱氢还原和酸水解后,得到不含β-(l-6)糖音链的在警异多糖,其具有很高的抑瘤活性。另外,无活性的葡聚糖经过去掉部分叙幡的修饰后,也具备了抗肿瘤活性。多糖的高级结构、分子结构等是重要的影响因素,在生物体内有与多糖直接结合的某种物质,如有的抗肿瘤活性多糖能打乱血清蛋白的d一螺旋结构,能暂时特异性地使某些血清蛋白成分增量。
5.2 增强免疫作用
     已证实不同的多糖具有不同的免疫促进作用。香菇多糖是理想的免疫促进刑,它作为T细胞定位的佐剂和辅助T细胞刺激参与机体免疫反应。现已发现,其具有高度特异性免疫增强作用。在带癌状态下一方面它能激活腹腔巨噬细胞的杀伤抗原能力;另一方面能恢复已降低的免疫功能,特别是能恢复T协助细胞的活性,同时近百倍地提高抗胸腺依赖性抗原的体液性抗体水平。银耳多糖能促进淋巴细胞的转化,增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,明显促进肝脏蛋白质核酸的合成以及促进骨髓造血功能,提高体液免疫力。黑木耳多糖可有效地提高小鼠巨噬细胞的吞噬指数和百分率。药理实验证明,茶多糖具有增强免疫功能,促进单核巨噬细胞系统吞噬功能的作用。研究表明:茶多糖是一种免疫促进剂,能明显促进巨噬细胞的吞噬能力,使免疫器官脾脏重量增加,其他多糖如大蒜、萝卜等提取的多糖对T淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬细胞分别具有不同的增强作用,可增强机体细胞免疫功能。
5.3
     降血糖、降血脂
     药理实验证明,茶多糖具有明显的降血糖的作用,其中有降血糖作用的多糖为牛乳葡聚糖。香菇多糖具有对胆固醇的溶解作用。肠膜状明串珠球菌因蔗糖发酵液中产生的右旋糖酐,其硫酸酯有阻止脂类异常引起的高血脂动脉硬化的作用。黑木耳多糖具有缓解动脉粥样硬化的功效。
5.4 抗病毒、抗细菌
     现已证实香菇中含有一种干扰素诱导剂,能干扰病毒蛋白质的合成,提高抗病毒免疫力。云芝多糖在小鼠体内也具有抗病毒作用,保护病毒性肝损伤,促进肝脏kupfer细胞吞噬功能和诱生干扰素的作用。中华猕猴桃多糖具有较强的抗细菌感染的作用。
5.5 抗辐射
     黑木耳多糖具有抗放射作用,对60Co照射的动物可提高存活率。茶多糖具有明显的抗辐射作用。研究结果表明:螺旋藻水溶性多糖能显著增强辐射引起的DNA的切除修复活性和程序外DNA合成,同时能显著减轻小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖细胞的辐射遗传损伤,大大降低辐射引起的突变频率。凌甲基获警多糖对60Coyr-r射线引起的小未用白血细胞数的减少有减轻作用。银耳孢子多糖具有抗放射作用。
5.6 抗氧化
     从长白山野生云兰中提取的彩云多糖(GVPS),给予荷瘤或受Y射线全身照射的小鼠,能使多种脏器和细胞内SOD活力升高,脂质过氧化物水平下降;ESR(电子自旋共振)研究表明,CVPS在黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶体系中具有直接清除ROS的作用。从另一种来源的真菌云芝得到的连接蛋白的多糖(PSK),对巨噬细胞LDL氧化修饰后GSH-Px活力降低和LPO生成增多有很好的抑制作用,能使这些指标恢复到接近正常。从湖北恩施地区野生筹竹叶中提取得到的几种不同结构的多糖均能增强机体的抗氧化防御机制。以四氯化碳致肝损伤后,小鼠肝线粒体、微粒体MDA含量急剧上升,SOD活力降低,给予菩叶多糖能显著抑制这种变化;
     Ca2+“氧化修饰低密度脂蛋白(LDL)后, MDA含量高达正常LDL的5倍以上,不同浓度的多糖对此有明显的抑制作用,并有剂量效应关系。从海带科植物海带中提取的低分子量岩藻聚糖硫酸酯(LMS)具有抗氧化、免疫调节等作用。高脂血症大鼠在血脂升高的同时,血清中W的含量显著升高,血清及组织中SOD活力降低,MSF能抑制这些变化,使上述指标恢复到接近正常。由中华猕猴桃的根中提取的多糖(ACPS)有较强的清除ROS及抗衰老的作用。在二甲亚砜于碱性条件下产生(及Fenton反应产生)OH-的发光体系中,ACPS可清除O-2和OH-,抑制化学发光。从宁夏拘妃子中提取得到的多糖具有抗氧化、抗肿瘤、防衰老及增强免疫力等方面的作用。对Fe2+-cys致大鼠肝线粒体损伤,构相多糖可抑制MDA含量上升、膜流动性下降,增加
     AIYase活性; H2O2致红细胞膜损伤后,若给予枸杞多糖可抑制脂质过氧化的发生。此外还有螺旋藻多糖、褐藻多糖、海藻硫酸多糖、大制技头多糖、猴头菌丝多糖、红藻多糖、南沙参多糖。自从蓉多糖、北五妹子多糖、魔芋多糖、硒化黄茂多问、硫酸化高山红景天多糖、淫羊藿多糖、鼠尾藻多、青竹梅多糖等均有一定程度的抗氧化作用。
     大量研究表明多糖具有清除ROS的抗氧化作用,其作用的机理,可能的解释有如下几种:(1)直接清除ROS。多糖可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的ROS,还少脂质过氧化反应链长度,因此可以阻断或减缓脂质过氧化的进行。对于OH-而言,可快速地攫取多糖碳氢链上的氢原子结合成水,而多糖的碳原子上则留下一个成单电子,成为碳自由基,进一步氧化形成过氧自由基,最后分解成对机体无害的产物;对于O-2多糖可与其发生氧化反应,达到清除的目的;对于单线态氧,可将激发能传递给多糖,使多糖处于激发态而本身回到基态(淬灭)。(2)络合产生ROS所必需的金属离子。多糖环上的OH可与产生OH-等所必需的金属离子(如
     Fe2+、Cu2+等)络合,使其不能产生起动脂质过氧化的羟基自由基或使其不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化氢,从而抑制ROS的产生。(3)促进SOD从细胞表面释放。多糖可通过促进SOD从细胞表面释放而发挥清除ROS的作用,进而阻止自由基引发的连锁反应,预防衰老的发生,例如岩藻聚糖硫酸酯的抗ROS损伤作用可能与SOD的释放有关。(4)提高抗氧化酶的活性。多糖可通过提高SOD、CAT、GSH-PX等酶的活性,从而发挥抗氧化的作用。
5.7 其他
     研究表明:黑木耳多糖具有抗血小板聚积,缓解动脉粥祥硬化的功效。九里香多糖和蛋白多糖具有抗生育,增强机体免疫功能的作用,对机体受内外因素所致的损伤具有一定的保护和修复作用。此外,还有抗凝血作用等。

   
6 多糖的发酵调控

   
   多糖的来源虽然很广泛,但是,多糖的大批量生产主要还是通过微生物的发酵作用来进行。各种理化因素都会影响菌的生长速度、生物量的多少及代谢特征等,同样,多糖的产生也会受到许多因素的影响,除了营养物质之外,其他环境因素也是相当重要的。从培养基中C/N的角度来讲,N含量高,有利于菌丝的生长,菌丝成率高;而C含量高时,应该更有利于多糖的积累,如:培养基中C/N比高,有利于荚膜细菌形成荚膜多糖。pH也是影响多糖合成的基本因素之一。另外,有研究发现,食用菌多糖的单糖组成还与培养基的组成有关系,特别是碳素养料的组成,研究液体培养蜜环菌产多糖的过程中发现,菌丝球的大小与多糖的产生存在一定的负相关,即菌丝球大,多糖产量低,这可能与菌丝和培养液的接触面积大小有一定的联系。